本文共 3962 字,大约阅读时间需要 13 分钟。
高分辨率熔解(High-resolution melting,简称HRM)分析是一门新兴的技术。它仅仅通过PCR之后的熔解曲线分析,就能检测PCR片段的微小序列差异,从而应用在突变扫描、序列配对、基因分型和甲基化分析等多个方面。
双链DNA的熔解分析可追溯到上世纪六十年代,当时是通过紫外吸收来监测的。分析需要几微克的DNA,而样品以0.1-1.0°C/分钟的速率缓慢加热,常常要花上几个小时才能完成。后来,LightCycler定量PCR仪的出现,让荧光熔解分析变得流行。样品量因毛细管而缩减至纳克级,且熔解速率更快,达0.1-1.0°C/秒,这样熔解时间缩短至几分钟。当时使用的染料是SYBR® Green I。
然而,这种熔解分析只能区分在片段大小和GC含量上差别较显著的DNA序列,比如检查PCR扩增产物中是否存在引物二聚体及其他非特异性的扩增。如果要区分SNP,分辨率还不够。为什么呢?这里有必要先介绍一下饱和染料和非饱和染料。SYBR Green I就属于非饱和性染料,由于它对PCR的抑制作用,在实验中的使用浓度很低,远未将DNA双螺旋结构中的小沟饱和。这样,DNA双链高温变性时,单链部分的荧光染料分子发生重排,荧光染料分子重新结合到双链DNA的空置位点,造成荧光信号没有变化,因此出现假阴性,特异性下降。
于是,饱和染料问世了。为什么称为饱和染料呢?因为它们即便在饱和浓度(荧光最大)下,也不会抑制PCR。故高浓度的染料饱和了DNA双螺旋结构中的小沟,在DNA解链过程中就不会发生重排,这样熔解曲线才有了更高的分辨率。目前市场上的饱和染料主要有LC Green、LC Green Plus、SYTO 9等几种。光有染料还不够,仪器也要相应升级呢。
扩增子的熔解曲线完全取决于DNA碱基序列。序列中如有一个碱基发生了突变,都会改变DNA链的解链温度。但是这个差异极小,只有零点几摄氏度,如果仪器的分辨率不高,是根本无法检测的。
那么什么样的分辨率才是高分辨率呢?根据仪器现有的功能测试,在熔解操作时每摄氏度至少要获得10个数据点,这是对仪器的最低要求。此外,温度均一性也同样重要。如果两孔之间温度相差0.1°C,就很可能导致最终的熔解温度相差0.1°C,这样就无法保证HRM分析结果的准确性。大多数常规定量PCR仪的孔间温度差在0.3-0.5°C,这也决定了它们无法胜任HRM。目前市场上有多个厂家提供HRM分析的仪器,包括Idaho Technology、Corbett(QIAGEN)、Roche等,有些是专供HRM的仪器,有些则是附带HRM功能的定量PCR仪。HRM的发明者—美国犹他大学医学院的Wittwer实验室曾评估了市场上多台仪器在基因分型和突变扫描上的性能1。他们发现,对于大部分仪器的准确基因分型来说,主要限制在于平板上的空间温度差异(Tm的标准偏差为0.020-0.264°C)。其它差异如数据密度、信噪比和熔解速率,也会影响杂合体的扫描。经过比较发现,空气加热型仪器以及样品温度单独控制的仪器有着更低的Tm标准偏差(0.018-0.065),而加热块型仪器则在0.092-0.274。
在拥有饱和染料和高分辨率仪器之后,HRM分析就可以开始啦。这个过程其实很简单,就是对PCR的扩增子进行加热,温度从50°C逐渐上升到95°C。在此过程中,扩增子逐渐解链,在到达熔解温度(Tm)时,DNA链完全分开。在HRM分析的初期,荧光强度很高,随着温度升高,双链DNA逐渐减少,荧光强度也就下降了。HRM仪器通过照相机,记录下荧光变化的整个过程。通过对数据的作图,就生成了熔解曲线。
果然够简单吧,连探针也无需设计,只要在常规PCR中加一个饱和染料即可。HRM既可以对未知突变进行筛查、扫描,也可以对已知突变进行分析。相对于传统的突变分析而言,操作步骤大大简化,时间和成本也降低了不少。而且样品经PCR扩增后直接进行HRM分析,无需转移,真正实现了闭管操作,降低了污染的风险。
正是凭借这些优势,HRM近年来广泛用于突变扫描、序列配对、基因分型和甲基化分析等应用中。
序列配对
序列差异分析常用的方法包括单链构象多态性、变性梯度凝胶电泳、变性高效液相色谱、测序等,这些方法都需要分离样品,之后进行多步反应,操作繁琐,耗时长,且PCR产物有污染的风险。而HMR在5分钟之内就能完成,无需额外的步骤,也容易开发成高通量筛选,且是唯一的闭管操作,增加了分析的可靠性,这些优势对于分子诊断分析而言,格外重要。在器官移植中,医生通常会检测兄弟姐妹的HLA,以便了解主要组织相容性是否匹配。利用PCR产物的熔解曲线,能快速配对HLA序列。与熔解温度(Tm)不同,那只是熔解曲线上的一个点,高分辨率熔解是分析整个熔解曲线。利用熔解曲线的形状作为指示剂,来显示杂合DNA所形成的异源双链的序列匹配。之后将两个DNA按1:1的比例混合,重新熔解,并将新曲线与原先的曲线进行比较,来验证序列的匹配。如果两个样品的序列不是完全相同的,那么混合后异源双链的熔解曲线形状会改变。
瑞典乌普萨拉大学的Olof Gidlöf等曾开发出线粒体基因组中两个超变区HVI和HVII的HRM分析,以分辨不同个体的DNA,作为法医鉴定中测序前的预筛选2。研究结果表明,线粒体DNA中HVI和HVII所存在的序列变异确实产生了熔解曲线形状的差异,能辨别不同个体的DNA,这样就能排除不匹配的法医材料,从而节省线粒体DNA测序的时间和费用。另外,与其它技术相比,HRM操作简单,价格低,能同时筛选大量的样本。
突变扫描
单碱基改变、插入、缺失都能通过HRM来检测。在灵敏度和特异性方面,高分辨率熔解也高于dHPLC在内的传统方法。当变异体为低等位基因片段时,它甚至比DNA测序还灵敏。测序只能检测低至20%的变异体,而HRM能检测的变异体低至2%。而且,测序所花的时间、费用和精力,与HRM是不可同日而语的。对于400 bp以下的PCR产物,扫描单碱基变化的灵敏度和特异性皆为100%。对于400到1000 bp的PCR产物,灵敏度为96.1%,特异性为99.4%。PCR产物中变异的位置不影响扫描准确性。尽管HRM是为检测杂合体(一个等位基因发生突变)而设计的,但它也能检测纯合体(两个等位基因都有突变)。对于半合子变异体(X连锁或Y染色体),最好将未知样品与已知野生型的样品混合。
LMNA基因的突变会导致多种失调,现在称之为核纤层蛋白综合征。由于待研究的个体颇多,故必须用一种特别灵敏且特异的方法来进行突变扫描。于是,Gilles Millat等就开发出适合LMNA突变扫描的HRM分析3。他们同时用了HRM和dHPLC两种方法,对64位患有扩张性心肌病的病人进行筛选。结果表明,凡是dHPLC或直接测序能检测出的基因变异,HRM分析也能轻松鉴定,且速度比dHPLC快2倍,还更为经济。研究人员认为,HRM分析是鉴定LMNA遗传变异的高灵敏、高通量的廉价方法。
基因分型
传统的基因分型方法不仅耗时费力,还需要购买价格不菲的探针。相比之下,HRM分析则是优势多多,无需扩增和制备,排除了污染的风险;探针的钱也省了;还能检测未知的变异体,这一点探针可无能为力。有了饱和染料,PCR产物全程被标记,因此所有的熔解区域都能检测到。对于同一扩增子内的不同杂合体,通过曲线形状的差异也能区分开。HRM大约能分辨93%的杂合体。大部分纯合体也能通过熔解来分辨,但不是全部。大约有4%的人单碱基变异体有着相同的Tm,且图像对称。在这种情况下,可以将已知的纯合体与未知的纯合体混合,再进行分析。Lasse Kristensen等曾为参与甲基代谢的关键基因(MTHFR、MTR和DNMT3b)开发出HRM分析,对它们进行基因分型,并在Rotor-gene 6000等仪器上进行检测4。他们认为,与基于TaqMan探针的基因分型相比,HRM分析更经济。无需使用探针,分析所需的优化也更少,成功率更高。与焦磷酸测序、SNP芯片等多种技术相比,HRM是最佳选择。
甲基化分析
HRM分析还为DNA甲基化状态的检测另辟蹊径。DNA样品通过亚硫酸氢盐的处理,将未甲基化的胞嘧啶转化成尿嘧啶。这样,原先未甲基化模板所产生的PCR产物比甲基化模板的Tm要低。HRM还能确定特定样品中甲基化的比例。将不同比例的甲基化和未甲基化DNA混合,制作出标准曲线,将样品的熔解曲线与之相比较,从而确定样品中甲基化的比例。异常的甲基化模式往往与癌症相关联,于是Erci Smith等开发并验证了快速定量DNA甲基化状态的HRM分析5。他们利用数学方法来标准化加热DNA所产生的原始荧光数据,从这些数据中计算出熔解开始和结束的温度,从而反映模板分子的甲基化水平。之后,他们还用已知甲基化水平的寡核苷酸及DNA进行了验证。他们发现,通过HRM分析这种快速单管的方法来定量甲基化是可靠的,引物容易设计,且无需专门的软件。所获得的参数提供了标本中甲基化的客观描述和定量,能用于标本之间的统计学比较。
综上,HRM技术应用广泛,操作简单又经济,结果精确且可靠,适合任何实验室使用。市场上有一些专供HRM分析的仪器,不过,那些带有HRM功能的定量PCR仪则更实用。QIAGEN的Rotor-Gene Q(Corbett Rotor-Gene 6000)就是全球第一台将实时扩增与HRM分析技术相结合的实时荧光定量分析装置。Rotor-Gene Q的温度均一性为0.01°C,温度分辨率为0.02°C,解决了温度均一性、精确性和分辨率的问题,实现了定量扩增与HRM的合二为一。
转载: